LncRNA Tmem235调控BMSC缺氧性凋亡促进激素性股骨头坏死修复

激素性股骨头坏死（SONFH）是一种临床上常见的进行性骨病，近年来发病率不断上升，占股骨头坏死总病例的25-51%。若不及时治疗，会导致股骨头结构改变及塌陷，引起髋关节疼痛及功能障碍。

研究表明，骨髓间充质干细胞（BMSC）可以促进骨修复，有望治疗早期激素性股骨头坏死。然而，SONFH有一个独特的病理因素，即患者股骨头坏死区的氧浓度通常低于1%，形成了局部缺氧微环境，可导致BMSC发生缺氧性凋亡，并限制了其成骨修复能力。因此，目前急需开发新方法来抑制缺氧引起的BMSC凋亡和提高BMSC移植的疗效。

贵州医科大学附属医院研究团队发现，长链非编码RNA Tmem235在这种缺氧环境中下调。他们通过一系列实验表明，Lnc Tmem235可抑制BMSC的缺氧性凋亡，从而改善BMSC治疗早期激素性股骨头坏死的效果。这项研究成果已发表在《Experimental & Molecular Medicine》杂志上。

文献封面截图^[1]

研究材料与方法

在这项研究中，研究人员从雄性SD大鼠中提取出BMSC，并利用赛业OriCell^®提供的大鼠BMSC成骨、成脂、成软骨诱导分化试剂盒验证了BMSC的诱导分化性能。然后，通过lncRNA芯片分析筛选出与BMSC缺氧性凋亡相关的lncRNA，并通过基因过表达和沉默分析来探究Lnc Tmem235抑制BMSC凋亡的具体机制。最后，利用雄性SD大鼠构建了早期激素性股骨头坏死模型，并在移植BMSC后利用micro-CT系统监测了骨结构和骨密度。

技术路线

探讨缺氧环境对BMSC的影响，通过lncRNA芯片和过表达等分析确定，Lnc Tmem235抑制了BMSC的缺氧性凋亡

通过过表达和干扰分析确定Lnc Tmem235通过调节BIRC5的表达，来抑制BMSC的缺氧性凋亡

深入分析机制后发现Lnc Tmem235与BIRC5 mRNA竞争性结合miR-34a-3p，从而促进BIRC5的表达

在早期激素性股骨头坏死模型中，Lnc Tmem235通过抑制BMSC的缺氧性凋亡，改善了BMSC移植的治疗效果

研究结果

01

Lnc Tmem235抑制BMSC的缺氧性凋亡

研究人员从骨髓中成功分离出BMSC，并探讨了不同缺氧环境对BMSC的影响。由于股骨头坏死区的氧气浓度低于1%，故他们用0%的氧气浓度来建立BMSC的体外缺氧模型。结果显示，BMSC暴露于缺氧环境后，线粒体膜电位和ATP水平下降，而ROS水平上升。同时，大量的BMSC发生凋亡。

考虑到lncRNA在细胞凋亡的调控中发挥重要作用，接下来有哪些lncRNA与缺氧诱导的BMSC凋亡有关呢？lncRNA芯片分析显示，在缺氧条件下有99个lncRNA上调，183个lncRNA下调。进一步分析表明，Lnc Tmem235在BMSC缺氧模型中的表达明显下调，且其表达随缺氧程度的加重和凋亡比例的增加而持续下调。这些结果表明，Lnc Tmem235可能与BMSC的缺氧性凋亡有关。

Lnc Tmem235基因座位于10号染色体上，处于BIRC5基因的下游。研究人员发现，Lnc Tmem235不具备编码蛋白质的能力，主要分布在BMSC的细胞质内。在缺氧条件下，Lnc Tmem235和Bcl-2的表达水平下调，Bax和CASP-3的表达水平上调，BMSC凋亡比例超过70%。然而，Lnc Tmem235的过表达逆转了这些结果，促进了BMSC在缺氧条件下的存活（图1）。这表明，Lnc Tmem235抑制了BMSC的缺氧性凋亡。

图1. Lnc Tmem235抑制了BMSC的缺氧性凋亡^[1]

02

Lnc Tmem235通过调节miR-34a-3p/BIRC5轴抑制BMSC的凋亡

那么，Lnc Tmem235是通过何种机制抑制BMSC的缺氧性凋亡呢？研究人员在BMSC中过表达Lnc Tmem235后，通过芯片分析来检测细胞的基因表达谱，发现BIRC5的表达明显上调。之后的qPCR分析证实了芯片分析的结果。作为凋亡抑制剂，BIRC5可直接抑制CASP-3和CASP-9的活性，阻断细胞凋亡。因此，他们推测Lnc Tmem235通过调节BIRC5的表达来抑制BMSC凋亡。

在上调Lnc Tmem235的表达后，他们用慢病毒干扰载体下调了BIRC5的表达，发现BIRC5的下调明显削弱了Lnc Tmem235的抗凋亡作用。相反，在Lnc Tmem235表达被下调后，BIRC5的过表达有效减轻了缺氧诱导的BMSC凋亡。这些结果证实，Lnc Tmem235通过调节BIRC5的表达来抑制BMSC的缺氧性凋亡。

研究人员推测，也许有某个miRNA与BIRC5 mRNA结合，而Lnc Tmem235通过竞争性结合miRNA来释放miRNA对目标基因的沉默，最终促进BIRC5的表达。他们通过生物信息学工具将目标锁定为miR-34a-3p。

通过RIP分析，他们发现miR-34a-3p的过表达明显增加了Lnc Tmem235和BIRC5 mRNA在miRNA核糖核蛋白复合物（miRNP）中的富集。荧光素酶活性分析也显示，miR-34a-3p可以与Lnc Tmem235或BIRC5 mRNA上的预测位点结合。后续分析表明，Lnc Tmem235可作为ceRNA，与BIRC5 mRNA竞争性结合miR-34a-3p，从而解除miR-34a-3p对BIRC5 mRNA的沉默，最终促进BIRC5的表达。

当BMSC处于缺氧状态时，Lnc Tmem235的过表达导致BIRC5表达被上调，细胞凋亡明显减少。在此基础上上调miR-34a-3p的表达，则BIRC5表达下降，细胞凋亡增加。这表明miR-34a-3p阻断了Lnc Tmem235的抗凋亡作用。之后，研究人员又上调了BIRC5的表达，发现细胞凋亡减少（图2）。这些结果表明，Lnc Tmem235通过调节miR-34a-3p/BIRC5轴抑制了BMSC的缺氧性凋亡。

图2.  Lnc Tmem235通过调节miR-34a-3p/BIRC5抑制了BMSC的缺氧性凋亡^[1]

03

Lnc Tmem235促进早期激素性股骨头坏死的修复

此外，研究人员利用脂多糖和甲泼尼龙建立了早期激素性股骨头坏死模型。他们发现，在骨坏死区的缺氧微环境中，大量的移植BMSC出现缺氧诱导的凋亡，严重限制了BMSC移植的效果。既然Lnc Tmem235能够抑制BMSC的缺氧性凋亡，那么它是否能改善BMSC对早期SONFH的治疗效果？

他们在过表达或沉默Lnc Tmem235后，用DiR标记BMSC，并与异种脱抗原松质骨（XACB）共同培养来构建组织工程骨，以修复早期SONFH模型。与对照组相比，Lnc Tmem235过表达组的DiR荧光强度和BIRC5表达水平更高，TUNEL阳性细胞的比例明显下降，而在Lnc Tmem235低表达组中，TUNEL阳性细胞比例增加。这表明Lnc Tmem235抑制了缺氧微环境中BMSC的凋亡，促进了BMSC的存活。

在手术后12周，他们通过多个指标评估了BMSC的修复效果。与对照组相比，Lnc Tmem235过表达组的缺损区完全修复，且骨组织趋于成熟。骨小梁数目、骨小梁厚度、骨体积、骨体积分数以及多个成骨标志物的水平都明显增加。相反，Lnc Tmem235低表达组的各项指标都明显低于对照组。这些结果表明，Lnc Tmem235通过抑制BMSC的缺氧性凋亡，改善了BMSC对早期SONFH的治疗效果。

结论

图3. Lnc Tmem235在通过移植BMSC修复早期SONFH中的作用和机制^[1]

总的来说，这项研究表明Lnc Tmem235通过调节miR-34a-3p/BIRC5来抑制BMSC的缺氧性凋亡，而这种抑制改善了BMSC对早期激素性股骨头坏死的治疗效果（图3）。这项研究为减少BMSC的缺氧性凋亡和改善BMSC移植的疗效提供了一个新的靶点和方法。